การวัดกิจกรรมต่อต้านทริปซิน UV-VIS

วัตถุประสงค์

เพื่อวัดกิจกรรมต่อต้านทริปซินของสารสกัดหรือสารประกอบจากพืชโดยใช้สเปกโตรสโคปี UV-VIS โดยประเมินความสามารถในการยับยั้งกิจกรรมของทริปซินบนพื้นผิว (เช่น BAPNA หรือเคซีน)

วัสดุ

• เอนไซม์ทริปซิน : ทริปซินจากวัว มักมาจากตับอ่อน (ผงแห้ง)
• สารตั้งต้น : N-Benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride (BAPNA) หรือ casein
• บัฟเฟอร์ : Tris-HCl (50 mM, pH 7.8) หรือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ซาไลน์ (PBS) (50 mM, pH 7.4)
• สารสกัด/สารประกอบจากพืช : ตัวอย่างทดสอบที่มีฤทธิ์ต้านทริปซิน
• ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) หรือตัวทำละลายที่เหมาะสมอื่น ๆ (หากจำเป็นในการละลายสารสกัดจากพืช)
• เครื่องวัดค่าสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV-VIS
• คิวเวตต์ : ความยาวเส้นทาง 1 ซม.
• อ่างน้ำ/ตู้ฟัก : ตั้งไว้ที่ 37°C
• สารหยุดการหลั่ง : กรดอะซิติก หรือ กรดไตรคลอโรอะซิติก (TCA, 10%)

วิธี

1. การเตรียมสารละลาย

   • สารละลายสต็อกทริปซิน : ละลายทริปซินในบัฟเฟอร์ Tris-HCl จนมีความเข้มข้นสุดท้าย 1 มก./มล. เตรียมส่วนย่อยและเก็บที่อุณหภูมิ -20°C
   • สารละลายพื้นผิว BAPNA : ละลาย BAPNA (1 มิลลิโมลาร์) ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl หรือไม่ก็ละลายเคซีน (1%) ใน PBS เพื่อทดสอบเคซีน
   • สารละลายสารสกัดจากพืช : ละลายสารสกัดจากพืชในตัวทำละลายที่เหมาะสม (เช่น DMSO) จนมีความเข้มข้นสุดท้าย 1 มก./มล. เตรียมสารละลายเจือจางต่างๆ สำหรับการกำหนด IC50

2. ตัวอย่างควบคุมและทดสอบ

   • การควบคุมว่างเปล่า : ประกอบด้วยบัฟเฟอร์และสารตั้งต้นแต่ไม่มีทริปซินหรือสารสกัดจากพืช
   • การควบคุมเชิงบวก : ประกอบด้วยทริปซินและสารตั้งต้นที่ไม่มีสารสกัดจากพืชเพื่อวัดกิจกรรมเอนไซม์สูงสุด
   • ตัวอย่างการทดสอบ : ประกอบด้วยทริปซิน สารตั้งต้น และสารสกัดจากพืชในความเข้มข้นต่างๆ เพื่อตรวจสอบฤทธิ์ยับยั้ง

3. การฟักไข่

   • ในแต่ละคิวเวตต์ ให้เติมส่วนประกอบต่อไปนี้:
     • การควบคุมแบบว่างเปล่า : บัฟเฟอร์ 900 µL + สารตั้งต้น 100 µL
     • การควบคุมเชิงบวก : บัฟเฟอร์ 800 µL + สารตั้งต้น 100 µL + ทริปซิน 100 µL
     • ตัวอย่างการทดสอบ : บัฟเฟอร์ 700 µL + สารตั้งต้น 100 µL + ทริปซิน 100 µL + สารละลายสารสกัดจากพืช 100 µL (เปลี่ยนความเข้มข้นของสารสกัดจากพืชสำหรับการศึกษาการยับยั้ง)
   • ผสมเบาๆ และฟักที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที

4. การยุติปฏิกิริยา

   • หลังจากระยะฟักตัว ให้เติมสารละลายหยุดการทำงาน (TCA 10%) 100 µL เพื่อยุติปฏิกิริยาในแต่ละคิวเวตต์ วิธีนี้จะทำให้โปรตีนตกตะกอนในการทดสอบเคซีน หรือหยุดการปล่อย p-nitroaniline จาก BAPNA

5. การวัด UV-VIS

   • สำหรับการทดสอบ BAPNA ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 410 นาโนเมตร (สอดคล้องกับสีเหลืองของ p-nitroaniline) โดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV-VIS
   • สำหรับการทดสอบเคซีน ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 280 นาโนเมตร เพื่อตรวจจับปริมาณไทโรซีนหรือกรดอะมิโนอะโรมาติกอื่นๆ ที่ปล่อยออกมาจากการย่อยเคซีน
   • บันทึกค่าการดูดกลืนแสงสำหรับแต่ละตัวอย่าง

หมายเหตุ

• ตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวทำละลายที่ใช้สำหรับสารสกัดจากพืชไม่รบกวนการทำงานของเอนไซม์หรือการวัด UV-VIS
• รักษาตัวอย่างทั้งหมดไว้ที่อุณหภูมิ 37°C ในระหว่างการฟักเพื่อให้เอนไซม์มีกิจกรรมเหมาะสมที่สุด
• ทำซ้ำตัวอย่างแต่ละชุดสามครั้งเพื่อให้แน่ใจว่าจะได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้

ผลลัพธ์และการตีความ

• การลดลงของการดูดกลืนแสงที่ 410 นาโนเมตร (สำหรับ BAPNA) หรือ 280 นาโนเมตร (สำหรับเคซีน) เมื่อมีสารสกัดจากพืช บ่งชี้ถึงการยับยั้งทริปซิน
• ความสามารถของสารสกัดจากพืชในการยับยั้งทริปซินสามารถวัดได้โดยการเปรียบเทียบกับตัวควบคุมเชิงบวก